H2Kd基因siRNA表达质粒的构建及在小鼠LAK细胞的表达-基础医学-职称论文网

【摘要】 目的构建针对BALB/C小鼠H2Kd基因siRNA表达质粒，观察其在小鼠LAK细胞的表达，为进一步研究H2Kd基因功能奠定基础。方法设计siRNA干涉靶序列，体外合成两段互补的寡核苷酸，通过与线性化的pSilencer 3.0H1连接,转化大肠杆菌DH5a扩增纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。采用siRNA表达质粒封闭小鼠LAK细胞MHCI（H2Kd）的表达，同时设空转染组和无关序列组，流式细胞术检测不同组别靶蛋白的表达。结果纯化的质粒分子量为2.8?Kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符, 流式细胞术检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达。结论成功构建了针对H2Kd基因的siRNA表达质粒并抑制了其表达。

【关键词】 质粒；H2Kd基因；小干扰RNA

ZHUANG Xuewei1, XIA xiyan2, SHAN Ningning1, WANG Hongchun1, ZHANG Yi1,

YANG Xiaojing1, LI Xiaoli1, ZHAO Shengmei1，　ZOU Xiong1

（1．Department of Clinical Laboratory, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China；

2. Department of Immunity, Jinan Health School, Jinan 250022, China）

To construct the siRNAs expressing plasmid aiming at the H2Kd gene and to explore the H2Kd expression in mouse LAK cells and function of H2Kd with the RNA interference technology. Methods First, a target sequence of the H2Kd gene was selected, then according to the sequence, two complementary oligonucleotides were lisated into psilencer 3.0H1, which was transformed into DH5a bacteria, and then it was amplified and purified to get the plasmid. The purified plasmid was identified by gel electrophoresis and sequencing. H2Kdtargeting siRNA plasmid was used in spleen lymphocytes of BALB/C mice. Flow cytometry(FCM) was used to determine the expression of H2Kd on the transfected and control cells. Results Gel electrophoresis and sequencing results showed that the plasmid was about 2.8?kb which was identical with the positive control, and the sequence was identical with what had been inserted. Also siRNA treatment significantly inhibited the expression of the targeted protein. Conclusion siRNAs expression plasmids aiming at the H2Kd gene have been successfully constructed and could inhibit the H2Kd expression.

Key words: Plasmid; H2Kdgene; siRNA

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是编码主要组织相容性抗原的基因群，其表达产物是参与抗原提呈和T细胞激活的关键分子，H2Kd是小鼠MHCI类分子，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用。双链RNA(dsRNA)诱导与之同源的mRNA降解, 从而导致转录后基因缄默 (post transcriptional genesilencing,PTGS)现象或机制被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)［1］。RNAi现象和机制的研究进展非常迅速，近年RNAi已被发展成为一个新的强有力的工具，在反向基因组学、基因治疗、抗病毒感染等方面显示出了巨大的潜力。本研究采用包含H1启动子的表达质粒pSilencer 3.0H1成功构建了针对H2Kd基因的siRNA表达质粒,并转染小鼠LAK细胞，H2Kd表达明显下降，为进一步研究H2Kd基因的功能及制造MHC表达下降动物模型奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株质粒pSilencer3.0H1购自Ambion公司;工程菌DH5a由山东大学医学院免疫研究所馈赠。

1.1.2 主要材料和试剂 T4 DNA连接酶、质粒的提取及纯化试剂购自Promega公司;RPMI1640培养基、胎牛血清，购自美国Gibco公司；脂质体购自Invitrogen公司；小鼠淋巴细胞分离液购自上海生化试剂公司；FITC标记的抗H2Kd单克隆抗体及同型对照购自美国BD公司。

1.1.3 测序引物质粒中插入片段的测序采用M13通用引物。上下游引物分别为： 5＇CACGACGTTGTAAAAGAC3＇，5＇GGACACATTTAACAATAGG3＇，由上海博亚生物技术有限公司合成。

1.1.4 动物 SPF级BALB/C小鼠12只，由山东大学实验动物中心提供，18～22?g，雌雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计选择互补于BABL/C小鼠H2Kd基因作为靶序列,合成目的寡核苷酸：5＇GATCCCGGAGCGATGAGCAGTGGTTCTTCAAGAGAGAACCACTGCTCATCGCTCTTTTTTGGAAA3＇，5＇AGCTTTTCCAAAAAAGAGCGATGAGCAGTGGTTCTCTCTTGAAGAACCACTGCTCATCGCTCCGG3＇；无关序列：5＇ACTGGAGCACAATCATCTGGG3＇,5＇TGGGTGCAGTGTGTGGAAAGGC3＇；由上海博亚生物技术有限公司合成，纯度＞99%。

1.2.2 合成的两段寡核苷酸构建质粒pSilencer 3.0H1 实验均按照《分子克隆》实验指南及试剂盒说明书进行，首先将合成的两段寡核苷酸等量混合，95?℃作用3?min,37?℃孵育1?h, 然后将结合的双链寡核苷酸与带有BamHI和HindⅢ粘性末端的质粒连接，最后将连接成功的质粒转化DH5a大肠杆菌, 经氨苄青霉素筛选, 挑选耐药菌落,大量培养,质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法。

1.2.3 质粒的鉴定用BamHI和HindⅢ进行双酶切鉴定，DNA琼脂糖凝胶电泳及应用M13的通用引物测序,以确定合成的寡核苷酸是否已经转入pSilencer3.0H1质粒中。

1.2.4 小鼠脾LAK细胞的制备常规无菌制备小鼠脾细胞悬液，小心加入淋巴细胞分离液中，2?000?r/min离心20?min(离心半径15?cm),吸取淋巴细胞层，用不含胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤3遍，收集淋巴细胞后，用含10%胎牛血清的RPMI1640稀释至浓度为1×109/L，置于含白细胞介素2（interleukin2，IL2）1?000?U/mL，10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，37?℃，5%　CO2中培养。

1.2.5 质粒转染小鼠脾LAK细胞培养36?h后调节细胞浓度,4×105/200?μL孔接种于24孔培养板中，随机分为6组,每组设5个复孔，加入质粒DNA与脂质体为4/1.25、 8/1.25、 4/2.5、8/2.5、 4/5、8 /5?μg/μL分别设为2、3、4、5、6、7组，单纯脂质体设为8组，空白对照和无关序列质粒设为1、9组，84?h后采用流式细胞仪检测蛋白抑制情况。

1.2.6 流式细胞术检测H2Kd的表达各组细胞每孔取100?μL与FITC标记的抗H2Kd单克隆抗体及同型对照混合培养30?min,流式细胞术检测siRNA对靶蛋白的抑制情况。

1.2.7 LAK细胞增殖反应转染后各组分别吸取细胞悬液200?μL于96孔培养板中，每组设5个复孔。培养96?h后，加入MTT 10?μL/孔，继续孵育4?h，吸弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）100?μL/孔,同时设空白对照组。混匀后置492?nm检测波长，645?nm参考波长处测定各孔吸光度（A），以A值的大小反应淋巴细胞活性。

1.3 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件行t检验，数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳用BamHI和HindⅢ进行双酶切经琼脂糖凝胶电泳检测发现,经碱裂解法提取的质粒大小与试剂盒中所带阳性质控质粒大小相同, 且分子量为2.8?kb,其大小与预期结果大致相同,见图1。

琼脂糖凝胶电泳

1：DNA Marker；2: 构建的质粒；3：阳性质控(空质粒)

Fig.1 Agarose gel electrophoresis

1: DNA Marker； 2: Constructed plasmid； 3:Positive plasmid2.2 基因测序结果见图2。测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符, 表明已经成功构建了针对H2Kd基因的表达质粒。

2.3 MTT测定LAK细胞的增殖活性在使用质粒和脂质体期间，各组的淋巴细胞均未见细胞形态学异常及细胞破碎等毒性改变；空转染组仅加入较大剂量（10?μg）脂质体，无关序列组加入的为非特异性序列，两组对细胞均无明显毒副作用。

2.4 质粒DNA对靶蛋白表达的影响不同剂量的质粒对靶蛋白均有明显的抑制作用，其中7组H2Kd蛋白的表达降低最明显，8组为空转染组，仅加入较大剂量转染剂，对靶蛋白无明显抑制作用，9组为无义序列组，非特异性序列并未引起H2Kd蛋白表达的下降，见表1，图3。图2 插入片断的测序图

Fig.2 Sequencing graph of the inserted fragment

表1 不同比例的质粒DNA/脂质体对靶蛋白的抑制作用

3 讨论

基因灭活技术包括反义核酸、基因敲除及干扰RNA技术等。反义核酸存在基因效率低的缺陷，而基因敲除具有高效的基因阻断效应，但技术要求高，费时，费钱。干扰RNA技术是近几年发展起来的一种反基因策略,可以特异性的抑制特定基因的表达，成为研究基因功能的良好工具。Wen等［2］在体内外成功实现了对siRNA的靶向运输，持续高效抑制了HBV的基因表达和复制。Zimmermann等［3］通过RNA干扰技术，首次在灵长类动物猴活体内沉默了一个载脂蛋白（apoliprotein B,Apo B）基因,开创了RNAi活体全身用药的研究。本研究采用的pSilencer 3.0H1 表达载体是用于培养的哺乳动物细胞中表达siRNA的一系列载体之一。此载体是用BamH I和Hind Ⅲ线性化且经过纯化的，方便定向克隆。当这种带有PolⅢ 启动子和siRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，能够下调特定基因的表达。

有研究报道外周血淋巴细胞表面MHC表达随年龄老化而降低［4］，与机体免疫力易随年龄老化而下降一致。Algarra等［5］提出肿瘤宿主MHC状态异常是肿瘤细胞免疫逃逸的机体环境因素不容忽视。这些研究提示应关注外周血淋巴细胞MHC抗原的表达。本课题组前期研究结果表明，肝癌、胃癌患者外周血淋巴细胞MHCI明显下降［67］。H2Kd是BALB/C小鼠的MHCI类分子，H2Kd降低的LAK细胞对异体敏感肿瘤株K562和自体实体瘤细胞株H22的杀伤活性明显降低［8］。为进一步研究H2Kd的功能，本研究拟制造外周血MHC下降的动物模型，成功构建针对H2Kd基因的siRNA表达质粒，能够更长时间地抑制目的基因表达。由于质粒可复制扩增，与化学合成相比，能够显著降低制备siRNA的成本。可自行制备siRNA而不受数量的限制。质粒DNA与小鼠脾LAK细胞混合培养后，H2Kd分子的表达率明显下降，同时，MTT法测定不同组别的细胞活性没有明显改变，倒置显微镜下观察，细胞形态亦没有明显的改变。质粒DNA及脂质体对细胞无明显毒副作用，对H2Kd蛋白表达的抑制作用不是通过非特异性毒副作用实现的，证明是抑制H2Kd蛋白表达的有效方法。

本研究采用pSilencer3.0H1成功构建了针对H2Kd基因的siRNA表达质粒并抑制其表达,为下一步制造外周血H2Kd下降的动物模型奠定了基础。

【参考文献】
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［8］单宁宁，邹雄，杨晓静，等.反义核酸封闭H2Kd基因对鼠淋巴因子激活杀伤细胞活性的影响［J］.中华医学检验杂志，2004，27(5)：327329.